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技術文章

NK-92細胞培養(yǎng)的注意事項

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NK-92細胞特性

NK-92細胞生長特性為懸浮生長,收到細胞后先觀察瓶身是否完整,無漏液現(xiàn)象,培養(yǎng)基是否澄清透亮,在顯微鏡下觀察細胞;

75%的酒精擦拭瓶身后將細胞培養(yǎng)瓶先豎立靜置2~4個小時,讓細胞沉降到底部;細胞靜置完后,將瓶中上面部分培養(yǎng)基小心吸出,留底部細胞和3ml左右培養(yǎng)基在原瓶;

吸出的細胞培養(yǎng)基離心收集細胞沉淀,離心轉速10003分鐘,或根據(jù)您的離心機實際情況而定,NK-92細胞對離心敏感,轉速不宜過高;用2~3mlNK-92完培將得到的細胞沉淀重懸后,放回原瓶繼續(xù)培養(yǎng)過夜,一個T25培養(yǎng)體積是5~6毫升;

NK-92細胞可按照200U/ml的濃度補加IL-2。

培養(yǎng)瓶為不透氣瓶蓋,一定要擰松到不掉的程度,使細胞充分透氣;培養(yǎng)瓶橫放,瓶口擰松透氣,培養(yǎng)過夜;

顯微鏡下觀察細胞,視細胞密度和培養(yǎng)基消耗情況,進行傳代。不建議直接進行離心操作,因為經過運輸顛簸和各種處理,細胞很可能達不到最佳狀態(tài)。盡量不要吹散細胞團,加完液輕晃培養(yǎng)瓶即可。

 

細胞培養(yǎng)注意事項

NK-92細胞為懸浮生長,大部分細胞聚集成團,少數(shù)細胞分散,并且細胞間隙會有較多的死細胞和細胞碎片,且培養(yǎng)過程中經常能觀察黑色的顆粒和小黑點,這些黑點大概是細胞帶的,一般少量黑點不增殖不會影響細胞的生長,若黑點繁殖生長則懷疑細胞污染,會影響細胞生長,甚至使細胞死亡。

NK-92細胞對IL-2敏感。培養(yǎng)基中IL-2降解,將導致細胞狀態(tài)變差。IL-2長期保存溫度為-20℃,解凍后置于4℃冰箱保存,4℃保存不應超過兩周。配制好的新鮮培養(yǎng)基要盡快用完,使用前預熱,使用完畢后放回4℃冰箱保存;

NK-92細胞對離心敏感。正常培養(yǎng)時,換液周期為2~3天,建議交替使用半量換液和離心換液法,即半量換液2~3次后,離心全量換液一次。盡量減少離心次數(shù),細胞狀態(tài)不佳或細胞量少的時候,一般不建議離心。

 

細胞團塊是否需要吹散?

團塊需要吹散,但不用刻意吹散成單顆;

正常傳代或者離心換液后吹打,控制吹打次數(shù)以及力度,即使細胞都分散成單個,也會在1~2天內聚集起來;細胞團太大時,需要分散;

細胞凍存的時候,細胞需要盡量分散,否則影響凍存效果。


換液方法
(1) 
補液法:2~3天補加適量(根據(jù)培養(yǎng)容器和原來細胞懸液體積來定,T25瓶一次補液1~2毫升即可)新鮮培養(yǎng)基,同時補加200U/mlIL-2,補加2-3次之后,離心全部換液。

(2) 半換液法:T25瓶子(瓶中裝有5ml培養(yǎng)基)為例,豎起瓶子靜置一段時間(豎瓶前輕拍培瓶,讓輕貼底部的細胞團浮起來),待細胞沉底(肉眼觀察細胞沉底情況),小心吸出2.5ml上清轉移到離心管,1000rpm 3~5min離心,離心后的細沉淀用2.5ml新鮮培養(yǎng)重懸后放回原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。細胞生長時,聚集的細胞團會逐漸增大,正常的細胞團在顯微鏡下呈現(xiàn)白色透亮狀。若細胞聚集太多,出現(xiàn)細胞團中部發(fā)暗時,可進行傳代。

 

傳代方法

將細胞團用移液器輕輕吹散(一般吹2-3次即可,吹打力度不可過大,否則會出現(xiàn)大量死細胞和細胞碎片),均分到兩個瓶子里,每瓶再補充等量培養(yǎng)基。細胞對營養(yǎng)要求很高,細胞量過多時會影響細胞生長;細胞團塊過大時,需要稍微吹散,注意控制吹打次數(shù),不需要全部吹散。

 

細胞凍存

推薦使用90%FBS+10%DMSO的凍存液配比,NK-92細胞可適量補加IL-2;盡量吹散細胞,注意控制吹打力度。

 

細胞復蘇

復蘇后,用6ml新鮮培養(yǎng)基,重懸細胞;離心后去除上清用1~2mL培養(yǎng)基重懸細胞,注意要少次輕柔吹打。
瓶子豎著放進培養(yǎng)箱,以增加細胞局部密度,瓶蓋保持透氣;
細胞生長需要穩(wěn)定的環(huán)境,可每天觀察1次,不要頻繁拿出培養(yǎng)箱觀察


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